利用布魯克的定量軟件包， 進行自由基和過渡金屬的鑒定和定量

EPR

利用布魯克的定量軟件包，

進行自由基和過渡金屬的鑒定和定量

秉持誠信 不斷創新

摘要

在科學研究和過程/質量控制中利用分析技術鑒定和定量特定物種，是一項挑戰。電子順磁共振（EPR）波譜就是這樣一項 技術，它適用于鑒定和定量液體或固體樣品中的自由基和過渡金屬離子。憑借獲由SpinCount和SpinFit模塊組成 的定量軟件包，布魯克讓EPR技術變得更易用、更便捷。該定量軟件包對于所有采用Xenon和Xepr軟件的布魯克EPR波譜儀 是標配，對于采用ESRStudio軟件的Magnettech ESR5000波譜儀是可選項。該定量軟件包可直接實現樣品的精準定量，而 無需與標準樣品或單獨測得的校準曲線進行比較。由此布魯克可為眾多不同的科學研究或過程/質量控制提供一種可靠易 用的解決方案。

引言

利用波譜技術對樣品中的特定物種進行定性或定量，是進行科學研究和過程/質量控制的基礎。電子順磁共振（EPR）波譜 讓研究人員能夠鑒定和定量樣品中的自由基和過渡金屬離子。和大多數光譜技術不同的是，EPR對樣品不透明度或濁度沒 有限制，且定量信息不依賴于消光系數的精度。通過EPR鑒定順磁性物質只取決于物種本身的性質。與核磁共振（NMR）波 譜等其他磁共振技術不同的是，EPR不受分子量的限制。只需對來自目標自由基或過渡金屬離子的EPR信號進行二重積分，  即可獲得定量信息，可以免于來自非順磁性物質的干擾。然而，即使是用EPR來鑒定物種也依賴于知識儲備，且定量時通常 需要花費大量時間去構建標準曲線。

為了解決所有光譜技術存在的共同局限及EPR存在的挑戰，布魯克打造出了榮獲SpinFit和SpinCount軟件包。該軟 件包能夠無需參比物直接定量和明確鑒定不同樣品中的順磁性物質。SpinCount讓研究人員能夠從原始數據中獲取定量信 息，而無需與標準樣品進行比較，亦無需用到校準曲線。SpinFit模塊及其中所含的常見自由基和過渡金屬離子的譜圖庫， 讓研究人員即使只具備很少的知識儲備也能鑒定出物種。取決于所用軟件，EPR波譜儀最多可配置來自SpinFit家族的三個 成員： Isotropic SpinFit、SpinFit Liquids和Aniso SpinFit。SpinFit通過將原始數據與一個小參數集進行擬合來輕松實現物 種鑒定，而用戶只需輸入很少的信息。Isotropic SpinFit和SpinFit Liquids是用于模擬和擬合溶液中的自由基和過渡金屬的 CW-EPR譜圖的程序。Isotropic SpinFit用于模擬和擬合非粘性溶液的各向同性譜圖。SpinFit Liquids對這一功能進行了擴 展，增加了測定溶液中自由基翻滾速度（旋轉相關時間）的功能。模擬不同運動狀態下的譜圖，需要在能自動確定運動狀態 的SpinFit Liquids中實現的不同理論描述。Anisotropic SpinFit用于模擬冷凍溶液和粉末的譜圖。

SpinCount無需參比物即可實現定量

. 高精度，無需參比物，通過二重積分直接利用原始數據計算出濃度

. 在SpinCount的計算中涵蓋了儀器參數的影響

. 集成于波譜儀的控制軟件，使得研究人員可在完成數據采集后立即輕松快速地實現自由基定量

圖1所示為，利用SpinCount進行290 K溫度下的硫酸氧釩（VOSO4）水溶液的定量。用戶只需在SpinCount中利用區域限定工具 選擇二重積分區域，該區域的二重積分然后被換算成樣品中的總自旋數、自旋摩爾濃度及單位體積自旋數(spins/mm3)。

圖1：實驗譜圖顯示為紅色。 通過對實驗譜圖進行二重積 分（藍色），SpinCount確定    出自旋數、摩爾濃度和自旋   數/mm3，如絕對自旋數報告 中所示。

一個重要的注意事項是不同的樣品條件。例如，觀測到的EPR譜圖會隨溫度的變化而變化，這會導致在不同溫度下研究的相同 樣品所獲得的二重積分不同。正如圖2所示，其中顯示了來自圖1的VOSO4樣品在150 K溫度下處于冷凍狀態時所觀測到的譜 圖。SpinCount在計算中考慮到了樣品溫度，因此可以提供一致的定量信息，而不受二重積分的變化影響。這也適用于未發生 相應溫度變化時的物理狀態改變，因為從液態到固態的相變會以類似的方式導致譜圖改變。

圖2：在150 K溫度下研究來 自圖1的、處于冷凍狀態的相 同VOSO4樣品。SpinCount采 用相同的二重積分方法從實 驗譜圖中計算出自旋數、摩 爾濃度及自旋數/mm3。

利用SpinFit模塊輕松快速地鑒定自由基

. 用于處理固態（Aniso SpinFit）和液態（SpinFit Isotropic和SpinFit Liquids）樣品中的自由基和過渡金屬物種

. 擁有鑒定時常見物種的譜圖庫

. 能夠鑒定和解析多個物種

. 與SpinCount輕松對接

. 自動選擇動態機制（SpinFit Liquids）

. 集成于波譜儀的控制軟件，使得研究人員可在完成數據采集后立即輕松快速地完成順磁性物質鑒定

順磁性物質的未成對電子會與它們的局部環境相互作用，從而產生可用于鑒定該物質的特征EPR譜圖。SpinFit通過將原始數 據與一個小參數集進行擬合來輕松實現物種鑒定，而用戶只需輸入很少的信息。當順磁性物種未知時，SpinFit擁有一個全面 的常見自由基和過渡金屬譜圖庫，并帶有相應的擬合參數，可幫助實現輕松快速的物種鑒定。由于處于液體和固體狀態的樣品 都能進行研究，SpinFit提供了不同的參數選擇來滿足每種樣品狀態所需考慮的不同參數。圖3所示為，利用SpinFit Isotropic來 擬合在290 K下研究的VOSO4樣品的譜圖。用戶只需輸入或上傳一組起始參數，SpinFit Isotropic即可自動找到精準地擬合該 譜圖所需的正確參數集。

圖3：處于液體狀態的VOSO4 樣品的實驗譜圖（藍色），顯   示出由8條譜線組成的特征   裂分譜線?源自未成對電  子與MI  = 7/2釩核之間的超  精細耦合。擬合譜圖所用的   參數顯示在Spin Fitting窗口中，獲得的擬合譜圖顯示 為紅色。

與此同時，Aniso SpinFit能夠滿足擬合固態樣品的譜圖所需的額外參數。圖4所示為，利用Aniso SpinFit來鑒定來自圖2的、處 于冷凍狀態的VOSO4樣品。和液態樣品一樣，用戶可以輸入或者直接從譜圖庫上傳所有參數。

圖4：在150 K溫度下研究來自圖1和圖3的VOSO4樣  品時，獲得了與固態樣品一致的譜圖。進行擬合時，Aniso SpinFit考慮了全   面描述固態樣品的譜圖所需 的額外參數。

SpinCount與SpinFit模塊聯用

. 即使信噪比低，也能實現高精度定量

. 解析多個重疊譜圖，以測定它們各自的濃度

. 借助SpinFit模塊也可獲得原始數據中包含的相同定量信息

前面的例子證明，SpinCount能夠將EPR譜圖轉換成樣品中的自旋數，SpinFit模塊能夠擬合EPR譜圖。研究人員面臨的一個常 見問題是，從含有多種順磁性物質的樣品中獲取定量信息時，會受到譜圖重疊的干擾。在這種情況下，無法利用譜圖的二重積 分來獲得單個物種的定量信息。通過將SpinFit與SpinCount的功能相結合，即可獲得含多種物質的樣品的定量信息。SpinFit 將實驗譜圖與包含多種物質的模型譜圖進行擬合，并分離出單個譜圖。然后，SpinCount通過計算而非二重積分來獲得定量 信息。例如，圖5中的譜圖即源自于由三張譜圖組成的重疊譜圖，每張譜圖對應于聚山梨酯的三種不同氧化產物之一。通過 SpinFit Isotropic鑒定出三種聚山梨酯自由基后，再通過SpinCount分別進行每種自由基的定量。如此，即使是含有多種物質的 樣品，SpinFit Isotropic也能輕松實現樣品中單個物種的鑒定和定量。

圖5：實驗譜圖（黑色）是從聚山梨酯自由基混合物中收 集到的原始數據。模擬譜圖   （藍色虛線）是分別顯示為黃色（烷基）、綠色（烷氧

基）和橙色（過氧基）的三張譜圖的總和。模擬譜圖是根據 各自所顯示的濃度對三份單張譜圖進行加權求和所得。SpinFit Isotropic同時計   算出每張譜圖及三張譜圖之  和，使得每個物種可被單獨   地分離出并進行分析。因此， 盡管譜圖重疊，SpinCount也 可利用該信息給出每個物種  的濃度。

圖6和圖7所示為，如何利用Aniso SpinFit 進行混合物樣品的鑒定和定量。本例中的譜圖源自于處于不同配位環境下的過渡金 屬配合物。通過對照Anisotropic SpinFit的譜圖庫，在譜圖中鑒定出低自旋和高自旋Fe(III)信號。Aniso SpinFit再自動找到精準 地擬合總譜圖所需的每個物種的正確參數。

圍6：實驗譜圖（藍色）源自于由處于不同配位環境下的 三種血紅素配合物組成的混合物樣品。該數據改編自   （Ruetz, M.等人，遠端配體   抑制硫化氫與人神經球蛋白 的相互作用，J. Biol. Chem., (2017) 292, 6512-6528）。通  過對照Aniso SpinFit的譜圖  庫，實驗譜圖被擬合（紅色） 成由三張不同Fe(III)譜圖疊   加而成的總譜圖，這三張譜   圖分別對應于一種高自旋配 合物和兩種低自旋配合物。 單張譜圖顯示在圖7中。

圖7中的譜圖是Aniso  SpinFit從圖6的實驗譜圖中鑒定出的單張譜圖。Aniso SpinFit根據每張譜圖對總譜圖的相對貢獻計算出 每個物種的濃度。

圍7：Aniso SpinFit鑒定出三 個Fe(III)物種，SpinCount再  對每個物種進行定量。從絕  對自旋數報告中可以得出， 樣品中的高自旋Fe(III)物種   （紅色譜圖）濃度為2.3 μM， 低自旋Fe(III)物種（藍色譜圖）濃度為47 μM，另一個低 自旋Fe(III)物種（橙色譜圖） 濃度為12 μM。

除了重疊譜圖，研究人員還經常面臨自由基濃度低導致數據的信噪比低的挑戰。濃度低可能是由樣本量受限或所研究反應的 收率低所造成的內在限制。雖然可以使用信號平均法，但這會非常耗時，或者可能受到快速反應動力學的限制。在這種情況 下，SpinFit與SpinCount聯用同樣可以發揮良好的作用。高噪聲的實驗譜圖被擬合成無噪聲的模擬譜圖，再通過模擬譜圖計算 出濃度。圖8中所示的條形圖，對比了重復測量自由基濃度為1 μM的樣品所得到的結果。通過二重積分確定濃度時，SpinCount 所得出的結果精度很低。如果先用SpinFit擬合高噪聲譜圖，再直接計算出濃度，則精度可大幅提高。

圖8：SpinCount通過對低濃  度樣品的EPR譜圖進行二重 積分（橙色）來獲得定量結果 時，所得到的RSD為21%。如果先擬合高噪聲譜圖，再 直接計算出濃度（藍色），則 精度可以提高，而所得到的 RSD為3%。

SpinCount和SpinFit讓二維數據分析變得更簡單

. 研究外部刺激因素對EPR譜圖的影響，從而構建二維數據集

. 考慮到外部刺激因素的物種鑒定和定量

布魯克EPR波譜儀擁有豐富的附件，可用于進行眾多不同類型的EPR研究。通常需要監測樣品溫度或原位紫外輻照等常見外  部刺激因素對EPR譜圖的影響。獲得EPR譜圖在外部刺激因素的影響下隨時間的變化趨勢，可供深入了解反應機制和動力學。 為了能以這樣的靈活性開展實驗，布魯克EPR波譜儀提供了一些可選的一維和二維實驗類型。但對于多維EPR數據，分析過程  可能非常耗時。為了解決這個問題，布魯克設計出了能夠逐層分析二維數據集的SpinCount和SpinFit軟件包。

圖9所示為，如何通過Isotropic SpinFit與SpinCount聯用，來測定混合物樣品（如圖5中的聚山梨酯）中濃度隨時間發生的變化。 雖然圖5中的單張譜圖能夠反映聚山梨酯發生氧化反應的過程，但隨著時間的推移和反應的進行，每個物種的濃度也在上升  或下降。演變譜圖能夠反映每個物種的濃度隨反應時間的推移而發生的變化。SpinCount的結果顯示，可以同時計算每個物種  的濃度。即，通過SpinFit和SpinCount的聯用，我們可以深入了解每個物種的反應機制或動力學，即使樣品中含有多種物質。

圖9：通過采集隨反應時間  而變化的EPR譜圖，來觀測  EPR 譜圖在聚山梨酯氧化  反應過程中的演變趨勢 。 濃度與時間的關系圖表明  了，SpinCount如何在SpinFit  的幫助下，同時追蹤圖5中所  示的每個物種濃度，即使它  們的譜圖重疊。

圖10給出了一個利用SpinCount進行硝苯地平自由基定量的例子。在本例中，硝苯地平自由基是通過紫外光照射1.5小時所產 生。從譜圖中的信號振幅不斷變大可以看出，自由基濃度隨照射時間的延長而增加。SpinCount通過逐一計算每個時間點的二 重積分，來體現自由基濃度隨時間的變化。

圖10：硝苯地平自由基是通 過紫外光照射所產生。該圖 所示為，譜圖振幅隨照射時 間的延長而不斷變大。絕對 自旋數報告表明，SpinCount 如何通過測定每個時間段的 濃度，來體現自由基濃度隨 紫外光照射時間的變化。

利用SpinFit Liquids進行分子運動分析

. 自動測定運動狀態

. 計算旋轉相關時間

CW EPR信號可以分為不同的運動狀態。（1）各向同性極限狀態：非粘性溶液中的快速運動分子；（2）中間狀態：分為快速和慢 速運動狀態，粘性溶液中的樣品或分子量較大以致于限制分子運動的分子；（3）剛性極限狀態：粉末、玻璃和冷凍溶液等固體 樣品。SpinFit Liquids模擬模塊適用于擬合所有液體樣品（包括中間狀態和各向同性極限狀態）的譜圖。模擬包含多個組分的 EPR譜圖，有助于研究復雜生物系統的動態。圖11所示為，與組氨酸激酶家族的一種蛋白質結合的ADP自旋標記類似物（ADP- NO）的EPR譜圖。從圖中可以看出，該譜圖是由兩個組分疊加而成：三條窄線代表溶液中的游離ADP-NO，而較寬部分代表與

蛋白結合的ADP-NO所產生的信號。分子運動速度通過旋轉相關時間τ（單位：ns）來描述。旋轉相關時間越短，分子運動速度

c

越大。SpinFit Liquids允許同時進行多個組分的模擬，從而獲得兩個組分的分子動態參數及它們的相對分數。這些研究可為了 解ATP依賴蛋白及生物聚合物的功能提供重要見解。